TOP2A-förstärkning och överuttryck i hepatocellulära Karcinomvävnader

Abstrakt

hepatocellulärt karcinom (HCC) är den främsta orsaken till cancerdöd hos män över hela världen på grund av begränsad insikt i patogenes och otillfredsställande effekt av nuvarande terapier. HER2-och TOP2A-gener samamplifieras i bröst och vissa andra cancerformer. I denna studie undersökte vi genavvikelser av HER2 och TOP2A och proteinuttryck av HER2, TOP2A, Ki-67 och p53 i tumör-och matchade icke-tumörvävnader, liksom deras föreningar med klinikopatologiska egenskaper. Genavvikelser utvärderades av fisk-och proteinuttryck av IHC. Varken HER2-överuttryck eller HER2 – genförstärkning observerades i både tumörvävnader och matchade icke-tumörvävnader. Däremot detekterades TOP2A-överuttryck i 72,5% av tumörvävnaderna men detekterades inte i matchade icke-tumörvävnader. TOP2A-genförstärkning observerades emellertid inte i både tumör-och matchade icke-tumörvävnader. TOP2A-överuttryck var signifikant associerat med HCC-tumörvävnader (P < 0,001), hepatit B-ytantigen (HBsAg) i serum (P = 0,004) och Ki-67 (P = 0.038) men inte med ålder, tumörstorlek, alfa-fetoprotein, TP53, och kopiera antal TOP2A gen och kromosom 17 centromer. Sammanfattningsvis var TOP2A-överuttryck i HCC inte sekundärt till genförstärkning. Dessutom kunde varken HER2-förstärkning eller överuttryck användas som prognostisk och prediktiv markör i HCC.

1. Inledning

levercancer är den näst ledande orsaken till cancerdöd hos män över hela världen . Bland primära levercancer är hepatocellulärt karcinom (HCC) den största histologiska subtypen globalt, med 78% av HCC hänförligt till hepatit B-virus (HBV, 53%) eller hepatit C-virus (HCV, 25%) . HCC är vanligtvis en aggressiv tumör som härrör från kronisk leversjukdom och levercirros. Prognosen för HCC är fortfarande dyster. Majoriteten av HCC-patienter är inte kandidater för botande terapier (kirurgisk resektion eller levertransplantation) på grund av avancerad eller oåterkallelig sjukdom vid presentationen, och de tillgängliga terapeutiska alternativen inkluderar lokala icke-kirurgiska metoder för tumörablation och systemisk terapi.

vissa onkogener, inklusive human epitelial tillväxtfaktorreceptor-2 (HER2) och topoisomeras II alfa (TOP2A), har undersökts i olika cancersubtyper som mål för cancerterapi, liksom biomarkörer för förutsägelse av svar. HER2-genen är en proto-onkogen belägen på kromosom 17 (17q11 .2-q12) och kodar för en 185 kDa transmembran tyrosinkinasreceptor. HER2 – genförstärkning i bröstcancer har blivit en viktig biomarkör för att förutsäga svar på HER2-riktad terapi . Men rollen av HER2-genstatus och HER2-proteinuttryck i HCC har varit kontroversiell . TOP2A-genen är belägen på kromosom 17 (17q21-q22), vid cirka 700 kb telomer till HER2-genlokusen . TOP2A-genen kodar för ett 170 kDa-kärnenzym som styr DNA-topologisk struktur, kromosomsegregering och cellcykelprogression . TOP2A-protein riktas mot flera kemoterapeutiska medel såsom antracykliner (doxorubicin, epirubicin) och epipodofyllotoxiner (etoposid, teniposid). TOP2A-genen koamplifieras med HER2-genen i cirka 35% av HER2-förstärkta bröstcancer, och TOP2A-koamplifiering, inte HER2-amplifiering, är den prediktiva markören för ett inkrementellt svar på antracyklinbaserad kemoterapi i HER2-förstärkta bröstcancer . TOP2A-överuttryck, det vill säga ökad nivå av TOP2A-mRNA och protein , har detekterats i HCC, men det är fortfarande oklart om TOP2A-överuttryck i HCC har uppstått från TOP2A-genförstärkning. Dessutom har ingen tidigare studie undersökt om TOP2A och HER2-koamplifiering finns i HCC. För att bestämma sambandet mellan TOP2A / HER2-förstärkning och TOP2A/HER2-överuttryck i HCC undersökte vi därför genkopianummer för både HER2 och TOP2A genom fluorescens in situ hybridisering (FISH) och proteinuttryck av HER2, TOP2A, såväl som Ki-67 och tumörprotein p53 (TP53) genom immunhistokemisk färgning (IHC). Därefter analyserades föreningarna av dessa genstatus och proteinuttryck med kliniska patologiska egenskaper statistiskt.

2. Material och metoder

2.1. Tumör och matchade tumörprover

fyrtio par hepatocellulärt karcinom (HCC) och icke-tumörvävnader från samma patienter erhölls genom kirurgisk resektion från operationsrummen, avdelningen för kirurgi, Ramathibodi sjukhus. Vävnader var snäppfrysta vid -80 msk C. frysta sektioner framställdes och färgades med hematoxylin och eosin (H&E). H &e färgade histologiska bilder granskades av en erfaren patolog. Prover kartlades med dessa h&E-bilder så att tumör-och matchade icke-tumörområden valdes för preparat av isolerade kärnor och för IHC-analys. Denna studie godkändes av Etikutskottet för forskning som involverar mänskliga ämnen vid Medicinska fakulteten, Ramathibodi Hospital, Mahidol University.

2.2. Beredning av isolerade kärnor för FISKANALYS

tjugotvå par frusen tumör och matchade icke-tumörvävnader var tillgängliga för beredning av isolerade kärnor för FISKANALYS. Isolerade kärnor framställdes med den tidigare rapporterade metoden . I korthet inkuberades utvalda vävnadsprover i 500 oc 0,9% NaCl pH 1,5 för 1 h vid 37 oc C, med tillfällig virvel. Vävnadssuspensioner tvättades med PBS (fosfatbuffrad saltlösning) och spändes genom en cellsil (BD Falcon, USA). Isolerade kärnor fixerades i Carnoys fixativ (3 : 1 metanol: ättiksyra). Slide preparat gjordes genom att släppa 8 oc av varje kärnor suspension på glasskivor och sedan torka dem i en 65 oc C ugn för 15 min. Beredningarna hölls vid -20 c-c tills de användes.

2.3. FISH-analys

HER2 och TOP2A genamplifiering bedömdes genom fluorescens in situ hybridisering med användning av PathVysion HER-2 DNA-sondkit respektive TOP2A DNA-sondkit (Vysis Inc., Downers Grove, Illinois, USA), enligt det förfarande som anges av tillverkaren med följande ändringar. I korthet inkuberades glidbanorna i 2xssc vid 75 kcal C i 20 min. Glidbanorna smältes sedan med pepsin (4 mg/mL i 0,9% NaCl, pH 1,5) i 5 minuter, doppades i vatten och sköljdes med 2xssc vid rumstemperatur i 5 minuter. Sonden och mål-DNA kodades vid 80 kg C i 5 minuter och hybridiserades i en fuktkammare över natten vid 37 kg C. Efter hybridisering avlägsnades täckglasen försiktigt och glidbanorna tvättades med 0,4 XSSC/0,3% NP-40 vid 73 kg C i 2 minuter. Glidbanorna överfördes sedan till 2xssc / 0,1% NP-40 vid rumstemperatur under 1 min. Kärnor motsattes med DAPI II (Vysis Inc., Downers Grove, Illinois, USA). Signaler räknades under ett fluorescensmikroskop (Olympus BX61) utrustad med en 100 W kvicksilverlampa. För att visa signaler användes enstaka bandpassfilter för spectrum green, spectrum orange och DAPI. Minst ett totalt antal 100 interfaskärnor fick poäng från de flesta prover. HER2-status bestämdes enligt ASCO / CAP-riktlinjerna . En HER2/centromer av kromosom 17 (HER2/CEP17) – förhållande på mindre än 1,8 ansågs vara HER2-negativ (HER2 icke-förstärkt), ett HER2/CEP17-förhållande mellan 1,8 och 2,2 som HER2 tvetydig och ett HER2/CEP17-förhållande högre än 2,2 som HER2-positiv (HER2 amplifierad). TOP2A-genförstärkning definierades som ett TOP2A / CEP17-förhållande 2.0, medan TOP2A-radering definierades som ett TOP2A / CEP17-förhållande 0.8. Fallet ansågs vara normalt när förhållandet TOP2A / CEP17 var mellan 0,8 och 2,0. Förstärkningen av kromosom 17 centromer definierades som den genomsnittliga CEP17 3 . Bilder av kärnor fångades av Cytovision software (Leica, Storbritannien).

2.4. IHC-analys

fyrtio par tumör-och matchade icke-tumörvävnader fixerades i 10% buffrad formalin och bearbetades sedan och inbäddades i paraffin. Seriella 4-mikron sektioner skars och placerades på positiva laddade bilder. Slides deparaffiniserades i xylen och hydratiserades genom graderade koncentrationer av etanol och slutligen destillerat vatten. Antigenhämtning utfördes i detta skede med 10 mM citratbuffert, pH 6,0, i en tryckkokare. Sektioner behandlades sedan med ett UltraVision lp-Värdedetekteringssystem (Lab Vision, USA). I korthet blockerades sektioner med Väteperoxidblock i 15 minuter vid rumstemperatur, följt av Ultra V-Block i 10 minuter vid rumstemperatur. Primär antikropp för varje markör applicerades vid en optimerad utspädning och inkubationstiden, såsom visas i Tabell 1. Sektioner inkuberades med värde primär Antikroppsförstärkare för 30 min vid rumstemperatur; sedan applicerades värde HRP-Polymer och sektionerna inkuberades i 1 h vid rumstemperatur. DAB (3, 3′-diaminobenzidin) användes som substrat för att avslöja uttrycket för varje markör. Slides motfärgades med hematoxylin och monterades i permanent monteringsmedium. Vävnader med utelämnande av den specifika antikroppen användes som negativa kontroller. Bilderna skannades med Pannoramic MIDI digital slide scanner (3DHISTECH, Ungern).

2.5. IHC-Färgningstolkning

enligt ASCO / CAP-riktlinjerna fick HER2-uttryck följande poäng: 0, ingen färgning; 1+, svag och ofullständig membranfärgning i >10% av tumörcellerna; 2+, svag till måttlig, fullständig membranfärgning i >10% av tumörcellerna; 3+, stark, fullständig membranfärgning i >30% av tumörcellerna.

cut-off-värdet för tumörprotein p53 (TP53) positivitet var en p53-färgning med positiva kärnor i 1% av cellerna i 1% av cellerna, oberoende av färgningsintensiteten. Ki – 67 proliferationsindex och TOP2A-uttryck bedömdes genom visuell uppskattning av andelen positiva kärnor i vävnaderna. Ki-67 proliferationsindex 10% av den totala proliferationsindexet har definierats som Ki-67 positivt. TOP2A expression 10% definierades som TOP2A-överuttryck genom immunhistokemi.

2.6. Serum hepatit B-ytantigen (HBsAg) – analys

Kemiluminescerande mikropartikelimmunanalyser (CMIA) för kvalitativ detektion av hepatit B-ytantigen (HBsAg) i serum från patienterna utfördes med arkitekt HBsAg kvalitativ II-analys (Abbot Laboratories, Illinois, USA).

2.7. Serum alfa-Fetoprotein (AFP) analys

Elektrokemiluminescensimmunanalyser (ECLIA) för kvantitativ bestämning in vitro av alfa-fetoprotein (AFP) i serum från patienterna utfördes med användning av AFP-kit med en cobas e601-analysator (Roche Diagnostics Limited GmbH, Mannheim, GM).

2.8. Statistiska analyser

statistiska analyser utfördes med SPSS v.11.5 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). Samband mellan TOP2A-uttryck och andra klinikopatologiska variabler bestämdes med användning av ett chi-kvadratiskt test ( test). Värden mindre än 0.05 ansågs statistiskt signifikanta.

3. Resultat

3.1. Kliniska patologiska egenskaper

fyrtio patienter (35 män, 5 kvinnor; åldersintervall 35-94 år, median 51 år) med resekterbart hepatocellulärt karcinom inkluderades i denna studie. Kliniska patologiska egenskaper sammanfattas i Tabell 2. Sextiofem procent av patienterna hade tumörstorlekar större än eller lika med 5 cm. Närvaro av HBsAg i serum detekterades hos 70% av patienterna. Trettiotvå procent av patienterna presenteras med serum alfa-fetoprotein (AFP) värden större än eller lika med 500 ng/mL. Positivt TP53-och KI-67-uttryck i HCC-vävnader detekterades i 45% respektive 75%.

3.2. Association of HER2 Gene Status and Protein Expression

HER2 protein overexpression was investigated in 40 pairs of tumor and matched nontumor tissues; HER2 – genförstärkning undersöktes i 22 par av vävnaderna. Resultaten visade att varken HER2-överuttryck ( par) eller HER2-genförstärkning (par) detekterades i tumörvävnader och matchade icke-tumörvävnader. Dessutom detekterades HER2-gendeletion (HER2 / CEP17-förhållande 0,8 0,8) i 9% (2/22) av tumörvävnader och förstärkning av kromosom 17 centromer (cep17 3 3) observerades i 50% (11/22) av tumörvävnader. Representativ cep17-vinst och dess negativa HER2-uttryck i tumörvävnad visas i Figur 1.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figur 1

representativ HER2 (röd signal) och CEP17 (grön signal) kopieringsnummer detekterat av FISH och HER2-proteinuttryck detekterat av IHC. (a)cep17 vinst med icke-förstärkta HER2 i fall 34, ursprungliga förstoring 1000 xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx. B) HER2 negativt uttryck i fall 34. C) HER2-förstärkning i bröstcancervävnad (positiv kontroll, ursprunglig förstoring av bröstcancer 1000). (D) HER2-proteinuttryck positivt 3+ i bröstcancervävnad (positiv kontroll, samma fall som (c)).

3.3. Förening av TOP2A-Genstatus och proteinuttryck

TOP2A-proteinöveruttryck undersöktes i 40 par tumör-och matchade icke-tumörvävnader; TOP2A-genförstärkning undersöktes i 22 par av vävnaderna som också användes för HER2-genförstärkningsstudie. Resultaten av TOP2A-genstatus är emellertid endast tillgängliga i 20 tumörvävnader och 18 matchade icke-tumörvävnader. TOP2A-överuttryck detekterades i 72,5% (29/40) tumörvävnader men detekterades inte i icke-tumörvävnader. TOP2A-genförstärkning detekterades emellertid inte i både tumörvävnader och matchade icke-tumörvävnader. Dessutom observerades TOP2A – gendeletion (TOP2A/CEP17-förhållande 0, 8 i kombination med HER2-gendeletion (HER2/CEP17-förhållande 0, 8 i 10% (2/20) tumörvävnader. En av tumörvävnaderna med TOP2A – gendeletion visade TOP2A-överuttryck (Fall 32), medan den andra tumörvävnaden inte visade något uttryck för TOP2A (Fall 34). Diskordansen mellan TOP2A – genkopianummer och TOP2A-proteinuttryck visas i Figur 2. Förstärkningen av kromosom 17 centromer (cep17 3 oc.) detekterades i 60% (12/20) tumörvävnader.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figur 2

förvirringen mellan TOP2A-genen (TOP2A, röd signal; CEP17, grön signal) kopieringsnummer detekterat av fisk och TOP2A-protein (brun signal) uttryck detekterat av IHC i fall av HCC. (a) fall 34: FISKRESULTAT visade top2a-radering (förhållande = 0,65, originalförstoringssug 1000) och negativt TOP2A-uttryck som visas i (b). (C) Fall 32: FISKRESULTAT visade top2a-radering (förhållande = 0,64, originalförstoringaboken 1000) och TOP2A-överuttryck (30%) som visas i (d). e) Fall 25: FISKRESULTATET visade normalt TOP2A (förhållande = 1,07, originalförstoringsscenariot 1000) och TOP2A-överuttryck (90%) enligt f.

3.4. Förening av TOP2A-proteinuttryck och andra kliniska patologiska egenskaper

TOP2A-överuttryck detekterades i 72,5% (29/40) tumörvävnader och signifikant associerad med HCC-vävnader (); med andra ord hittades det bara i HCC-tumörvävnader. Dessutom var TOP2A-överuttryck i tumörvävnader också signifikant associerat med HBsAg i serum () och Ki-67-uttryck (). Ändå fanns det ingen signifikant association av TOP2A-överuttryck med ålder, tumörstorlek, AFP, TP53-uttryck, cep17-kopianummer och TOP2A-genkopianummer, vilket visas i tabell 3.

4. Diskussion

i den aktuella studien hade 65% av patienterna tumörstorlek 5 cm, vilket indikerar att dessa HCC-patienter diagnostiserades i ett senare skede, och även 70% av patienterna hade HBV-associerad HCC, vilket indikeras av närvaron av HBsAg i serum. Vi fann också att dessa HCC-vävnader ofta uttryckte TP53 (45%) och Ki-67 (75%), liknande tidigare rapporter . Det har rapporterats att förekomsten av HBV och frekvensen av TP53-uttryck är högre hos asiatiska HCC-patienter än hos amerikanska HCC-patienter .

HER2-förstärkning och överuttryck finns i flera cancerformer inklusive bröst -, äggstocks -, endometrie-och bukspottkörtelcancer . HER2-överuttryck är vanligtvis ett resultat av HER2-genförstärkning. Dessutom är HER2-förstärkning såväl som överuttryck associerad med dålig prognos vid bröstcancer och har blivit en viktig biomarkör prediktiv för svaret på HER2-riktad terapi . Däremot har undersökningen av HER2-genstatus och uttryck i HCC gett varierande resultat. Även om vissa studier rapporterade att HER2 förstärks och överuttrycks i HCC-vävnader , Xian et al. och Bacaksiz et al. slutsatsen att överuttryck såväl som förstärkning av HER2 är ovanligt i HCC. Hsu et al. rapporterade också att HER2-överuttryck är sällsynt hos patienter med avancerad HCC. Våra resultat visade emellertid att HER2 varken förstärktes eller överuttrycktes i både tumörvävnader och matchade icke-tumörvävnader, vilket överensstämmer med resultatet av Vlasoff et al. . Vidare visade våra resultat att det genomsnittliga kopiantalet kromosom 17 centromer ( CEP17) var signifikant högre i tumörvävnader än i matchade icke-tumörvävnader (versus , ), men vinsterna av CEP17 i HCC var inte associerade med HER2-överuttryck. Detta överensstämmer med vår tidigare studie i bröstcancervävnader som, i frånvaro av HER2-förstärkning, vinster av CEP17 inte har någon signifikant effekt på HER2-uttrycket . På grund av dess sällsynthet eller frånvaro drog vi slutsatsen att varken HER2-förstärkning eller överuttryck kunde vara en vanligt använd prognostisk och prediktiv markör i hepatocellulärt karcinom.

TOP2A-genen kodar för en 170 KDa-nukleär enzym som kontrollerar DNA-topologisk struktur och samamplifieras ofta med HER2-genen i bröstcancer och blåscancer . TOP2A-genförstärkning och TOP2A-radering kunde hittas i 35% respektive 5% av HER2-förstärkt bröstcancer; emellertid kunde endast TOP2A-genradering detekteras i 3% av HER2-icke-förstärkt bröstcancer . Det har rapporterats att koamplifiering av HER2 och TOP2A vid bröstcancer är förknippad med känslighet för antracyklin . TOP2A-koamplifiering i HER2-förstärkt bröstcancer kan orsaka ökad känslighet för TOP2A-hämmare genom att inducera överuttryck av TOP2A-proteinet . Vidare har TOP2A-uttryck rapporterats vara en värdefull prognostisk markör för tumörframsteg, återfall och prediktor för sämre överlevnad i småcellig lungcancer, äggstockscancer, kolon, bröst och prostatacancer samt nasofaryngealt karcinom . TOP2A-överuttryck är en stark indikator på dålig prognos vid prostatacancer och i nasofaryngealt karcinom samt i undergruppen HER2-negativ bröstcancer . Några studier har funnit TOP2A överuttryck i HCC . Det har emellertid ännu inte fastställts om TOP2A-överuttryck i HCC har uppstått från TOP2A-genförstärkning.

i denna studie var TOP2A signifikant överuttryckt i HCC-tumörvävnader (), men TOP2A-genförstärkning detekterades inte i dessa vävnader, såväl som ingen signifikant samband mellan TOP2A-proteinuttryck och TOP2A-genkopianummer. Baserat på dessa resultat har vi för första gången visat att TOP2A-överuttryck i HCC inte uppstod från TOP2A-genförstärkning. Tidigare rapporterade vissa studier i prostatacancer, bröstcancer och magkarcinom också att TOP2A-överuttryck inte är nära korrelerat med TOP2A-förstärkning, i motsats till den starka korrelationen mellan HER2-överuttryck och HER2-förstärkning . Dessutom, Schindlbeck et al. drog slutsatsen att TOP2A-proteinuttryck snarare kan vara målet för antracyklin oberoende av genkopianummer . Isaacs et al. har visat att TOP2A är starkt reglerad på transkriptionell och translationell nivå, vilket tyder på att TOP2A-överuttryck kan uppstå från avvikelse på transkriptionell eller translationell nivå. Dessutom, Srikantan et al. har nyligen identifierat det RNA-bindande proteinet HuR och mikroRNA miR-548c-3p som de avgörande mediatorerna som kontrollerar TOP2A-uttrycksnivåer och bestämmer effektiviteten av doxorubicin .

så vitt vi vet är denna rapport den första studien som visar en statistiskt signifikant samband mellan TOP2A-överuttryck och HBsAg i serum (). Denna förening måste dock valideras på grund av den relativt lilla provstorleken för denna studie och de flesta av HCC-patienterna i den aktuella studien är HBsAg-positiva. Ett signifikant samband mellan TOP2A-överuttryck och Ki-67-uttryck i HCC-vävnader () har också observerats i den aktuella studien. Ki-67-protein är ett humant kärnprotein som endast uttrycks i prolifererande celler under alla de aktiva faserna i cellcykeln (G1, S, G2 och m-faser) men inte i vilande celler (G0), medan TOP2A-uttryck är odetekterbart fram till sen S-fas , toppade i G2-M-fas och minskade när cellerna slutförde mitos . Både Ki-67 och TOP2A-uttryck kan användas som molekylära biomarkörer för cellproliferation i olika cancerformer. TOP2A-uttryck är starkt korrelerat med Ki-67-uttryck i bröstcancer . Dessutom Har Ki-67-uttryck visat sig korrelera med tumörtillväxt och dålig prognos i HCC .

TOP2A överuttryck i HCC har prognostisk betydelse. Watanuki et al. fann att TOP2A-överuttryck i HCC verkar vara kopplat till en potentiellt aggressiv tumörfenotyp och cancerrelaterad död . Dessutom, Wong et al. rapporterade att TOP2A-överuttryck i HCC korrelerar med tidig ålder, kortare överlevnadstider och resistens mot doxorubicinbaserad kemoterapi . Därför behövs nya TOP2A-riktade kemoterapeutiska medel med bättre effekt. Mekanismer för doxorubicinresistens tros involvera induktion av multidrugsresistens (MDR) medierad av ATP-beroende läkemedelsutflödespumpar, i synnerhet ABCB1 (MDR1, Pgp) och ABCC1 (MRP1), liksom den samtidiga ökningen av nivån av topoisomeras I. således kan detektering av TOP2A-överuttryck i HCC-vävnader hjälpa till att välja lämpliga patienter för tidiga kliniska prövningar av de nya TOP2A-riktade terapeutiska medlen, som bör inkludera en ny klass av topoisomeras II-hämmare med potential att antimultidrugsresistensförmåga och dubbla topoisomeras i-och II-hämmare .

Sammanfattningsvis fann vi att (1) HER2 varken förstärktes eller överuttrycktes i både HCC-tumörvävnader och icke-tumörvävnader; (2) TOP2A-överuttryck i HCC-tumörvävnader uppstod inte från TOP2A-genförstärkning och var oberoende av HER2-genförstärkning eller överuttryck; och (3) TOP2A-överuttryck var signifikant associerat med HBsAg i serum, liksom med Ki-67-uttryck. Således kan HCC-patienter med TOP2A-överuttryck vara potentiella kandidater för nya TOP2A-riktade terapeutiska studier.

intressekonflikt

författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt när det gäller publiceringen av detta dokument.

bekräftelser

författarna tackar Professor Amnuay Thithapandha för hjälp med att redigera papperet. Ekonomiskt stöd till detta arbete var genom ett forskningsbidrag från Ramathibodi Foundation, Ramathibodi Hospital.

kompletterande material